circRNA是一大类非线性RNA,作为调控因子发挥着巨大作用。circRNA具有大量存在,进化保守,在细胞质中相对稳定的特点。这使得circRNA具有许多的功能,例如作为miRNA的海绵,绑定RNA形成RNA-蛋白复合物,调控基因的转录。circRNA测序能够在整体水平上解释样品中circRNA的分类信息、表达量信息等,通过分析其与miRNA的互作关系探讨ceRNA调控机制。
适用范围
基础研究：
1）人类正常组织、细胞、发育阶段的circRNA表达谱
2）疾病或者肿瘤组织中环状RNA表达谱
3）circRNA的功能和调控机制研究
临床运用：
1）新型的分子标志物
技术优势
1）文库优化：采用核糖体去除、链特异性文库构建、以及RNase R消化方案,全面捕捉circRNA片段
2）物种多元：可以检测几乎任何动植物的环状RNA
3）结果精准：多款circRNA预测鉴定软件
4）ceRNA机制：多种ncRNA联合分析,全面解读生命现象
5）经验丰富,实验流程成熟,数据可靠
实验流程
生信分析
技术参数
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样本要求 |
动物：≥1 g 植物：≥2 g 真菌：菌丝或者菌体称重（每管200 mg），≥3管 全血：≥ 2 mL 细胞：≥ 5×106 cells |
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RNA要求 |
≥5 μg，200 ng/μL |
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建库测序 |
去核糖体，去线性，链特异性文库，Illumina PE150测序 |
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数据量 |
10G clean data |
案例一：环状RNA标记预测胰腺导管腺癌对吉西他滨的耐药性研究
吉西他滨是一种晚期胰腺癌重要治疗药物，在疾病治疗过程中起重要作用。本篇文章作者首先获得吉西他滨的耐药细胞株，通过手段对比耐药细胞株和正常细胞株中环状RNA的表达谱。作者选取差异表达前10的环状RNA进行环状RNA定量PCR验证测序结果,准确性高达100%，说明测序结果真实可靠。
研究思路：
分析结果：
图1 PANC-1-GR细胞与亲代PANC-1细胞的circRNA表达谱,差异基因表达分析显示,126个circRNA在这两种细胞系中的表达存在显著差异，与PANC-1细胞相比，PANC-1-GR细胞中有68种上调，58种下调。
图2 利用TargetScan进行序列分析，分析两个circRNAs的潜在结合miRNAs，结果预测chr14：101402109-101464448C和chr4：52729603-52780244C能够结合一系列已知功能的miRNA，提示它们在PDAC对吉西他滨耐药中的潜在作用。
案例二：脱水胁迫下小麦叶片环状RNA及其靶标的鉴定
河南农业大学的研究团队利用，首次在小麦幼苗叶片中鉴定出大约88个环状RNA分子，而在脱水胁迫幼苗中有62个环状RNA分子存在差异表达。在脱水反应的环状RNA分子中，有6个在小麦中作为26个相应的miRNA的海绵。利用qPCR验证16个环状RNA，包括6个miRNA海绵和10个随机选择的环状RNA，其中14个环状RNA与测序结果趋势一致,反应测序数据的真实性可靠性。GO分析和KEGG分析揭示circRNAs潜在的生物学功能，例如所涉及的参与脱水反应过程，如光合作用，叶绿素代谢，氧化磷酸化，氨基酸生物合成、代谢以及植物激素信号转导和生长素生物合成等。并且揭示了环状RNA与小麦叶片脱水抗性相关功能基因表达之间关系。
研究思路：
分析结果：
图1 根据序列读数，通过CIRI软件在两个小麦叶片处理中共鉴定出88个候选的circRNAs。其中6个（6。8%）是由单个蛋白质编码基因外显子产生的外显子CircRNA，53个（60.2%）是由基因间区（基因间区CircRNAs）产生的，2个（2.3%）circRNA由内含子产生,另两个（2.3%）由单个蛋白质编码基因的反义链产生,分别称为内含子和反义circRNAs。其余25个（28。4%）的circRNA是由正义重叠区域产生的。
图2 为了解与差异表达的circRNAs相关的基因功能，使用BLAST2GO软件进行GO分析。GO功能分类从539个预测的mRNA中生成了843个注释,其涉及参与脱水反应过程,如光合作用,叶绿素代谢,氧化磷酸化,氨基酸生物合成、代谢以及植物激素信号转导和生长素生物合成等。
参考文献：
[1] Shao F, Huang M, Meng F T, et al. Circular RNA Signature Predicts Gemcitabine Resistance of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma[J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 584.
[2] Wang Y X, Yang M, Wei S M, et al. Identification of Circular RNAs and Their Targets in Leaves of Triticum aestivum L. under Dehydration Stress[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 7(2024).
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